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Entdeckung der semikonservativen Replikation

Grundprinzip - Entdeckung - Replikation im Detail - Polymerase-Kettenreaktion - Fehler der Repl. - Evolution der Repl.

Lernziele

Wenn Sie diese Seite durchgearbeitet haben, sollten Sie wissen

  • wie die drei hypothetischen Replikationsmechanismen der DNA heißen und wie sie ablaufen,
  • dass die DNA-Replikation nach dem semikonservativen Mechanismus abläuft.
  • was man unter einer Dichtegradientenzentrifugation versteht,
  • was man unter schwerer und leichter bzw. 14N- und 15N-DNA versteht,
  • wie Meselson und Stahl mit Hilfe der 15N-Markierung und einer Dichtegradientenzentrifugation nachgewiesen haben, dass der Replikationsmechanismus semikonservativ ist.

Grundsätzliches

Rein theoretisch könnte sich die DNA auch auf mehrere andere Weisen verdoppeln. So wurden in der Frühzeit der DNA-Forschung drei verschiedene Replikationsmechanismen diskutiert: der konservative, der semikonservative und der disperse Mechanismus. Diese drei möglichen Mechanismen werden durch das folgende Bild schematisch dargestellt.

Drei theoretisch mögiche Replikationsmechanismen: konservativ, semikonservativ und dispers

In der oberen Reihe sehen wir jeweils die DNA, die verdoppelt werden soll. In der Reihe darunter kann man das Ergebnis der Replikation, die Tochter-DNA, erkennen.

  • Bei der konservativen Replikation wird einfach eine vollständige Kopie der Mutter-DNA gemacht. Die ursprüngliche DNA bleibt vollständig erhalten, die neu synthetisierte DNA ist komplett aus neuen Nucleotiden zusammengesetzt.
  • Bei der semikonservativen Replikation bleibt die ursprüngliche DNA in jedem Tochter-Molekül zur Hälfte erhalten. Die andere Hälfte wird neu ergänzt.
  • Die disperse Replikation verläuft im Prinzip ähnlich, auch hier bleibt in jeder Tochter-DNA die Hälfte der Mutter-DNA erhalten, die andere Hälfte wird durch neue Nucleotide ersetzt. Allerdings läuft die Neusynthese der DNA völlig anders ab als bei der semikonservativen Replikation. Bei der dispersen Replikation sind alte und neue Nucleotide stark vermischt.

Heute wissen wir, dass die DNA semikonservativ verdoppelt wird. Die Einzelheiten dazu finden Sie auf der nächsten Seite.

Das Meselson-Stahl-Experiment

Wie hat man eigentlich herausgefunden, dass die DNA semikonservativ verdoppelt wird?

Bereits Watson und Crick hatten 1953 in ihrer ersten Veröffentlichung zur Struktur der DNA einen semikonservativen Replikationsmechanismus vorgeschlagen. Beweisen konnten sie diesen Mechanismus allerdings nicht, er war rein hypothetischer Natur, aber durchaus logisch.

Matthew Meselson und Frank Stahl, die am California Institute of Technology arbeiteten, wollten es 1958 genau wissen: läuft die Replikation tatsächlich nach dem semikonservativen Mechanismus ab? Um diese Versuche zu verstehen, müssen wir hier aber zunächst einmal etwas ausholen.

Betrachten wir dazu das folgende Bild:

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Dichtegradientenzentrifugation von normaler 14N- und schwerer 15N-DNA

Wir sehen hier zwei Versuche. In dem ersten Versuch hat man eine Probe normaler DNA in ein Reagenzglas mit einer Cäsiumchlorid-Lösung gegeben. Der Farbverlauf in dem Reagenzglas deutet es schon an: Die Cäsiumchlorid-Lösung hat nicht überall die gleiche Konzentration. Die Lösung ist oben im Reagenzglas noch recht dünn, während sie nach unten hin immer konzentrierter wird. Man spricht hier auch von einem Dichtegradienten, denn die Dichte der Lösung nimmt von oben nach unten hin kontinuierlich zu.

Einen solchen Dichtegradienten können Sie selbst übrigens ganz leicht zu Hause herstellen. Nehmen Sie ein möglichst hohes Wasserglas, geben Sie ein paar Löffel Zucker auf den Boden des Glases und lassen Sie dann vorsichtig Wasser in das Glas laufen, bis es voll ist. Wenn Sie das Glas nun eine längere Zeit stehen lassen, bildet sich ein Dichtegradient aus. Unten im Glas ist die Zuckerlösung ziemlich konzentriert, oben im Glas ist sie dagegen noch sehr verdünnt.

Nachdem man die DNA-Probe auf diesen Dichtegradienten gegeben hat, zentrifugiert man das Reagenzglas mit einer sehr hohen Umdrehungsgeschwindigkeit. Dadurch wird die DNA-Probe in Richtung Reagenzglas-Boden gezogen. Während dieser "Wanderung" kommt die DNA in Regionen mit immer größerer Dichte. Irgendwann ist die Dichte der Cäsiumchlorid-Lösung genau so groß wie die Dichte der DNA-Probe. Ab hier sinkt die DNA-Probe nicht mehr weiter.

Kommen wir nun zum zweiten Versuch, im Bild rechts dargestellt. Hier hat man keine "normale" DNA-Probe auf den Dichtegradienten getan, sondern sogenannte "schwere DNA". Was versteht man darunter?

Aus dem Chemieunterricht der Stufe 8 oder 9 sollten Sie den Begriff Isotop kennen. Unter Isotopen versteht man Atome, die zwar die gleiche Anzahl an Protonen besitzen, aber eine unterschiedliche Anzahl an Neutronen. Stickstoff-Atome haben normalerweise 7 Protonen und 7 Neutronen im Atomkern, daher haben sie die Atommasse 14, und man schreibt kurz 14N. Neben diesen "normalen" N-Atomen gibt es aber auch N-Atome, die ein zusätzliches Neutron im Kern haben. Diese Stickstoff-Isotope haben dann die Atommasse 15, und man bezeichnet sie als 15N.

Wenn man Bakterien nun auf einem Nährboden wachsen lässt, der solche 15N-Isotope enthält, dann bauen die Bakterien viele 15N-Atome in ihre DNA ein. Und da 15N-Atome etwas schwerer sind als 14N-Atome, ist auch solche 15N-DNA etwas schwerer als die normale 14N-DNA.

Bei der Dichtegradientenzentrifugation sieht man diesen Unterschied plastisch. Die schwere 15N-DNA sinkt etwas weiter in Richtung Reagenzglas-Boden als die Probe mit normaler 14N-DNA.

Der eigentliche Versuch

Wir kommen nun zum eigentlichen Meselson-Stahl-Versuch. Die Forscher ließen Bakterien auf einem 15N-Nährboden wachsen. Die aus den Bakterien isolierte DNA wurde dann einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen, das Ergebnis haben wir bereits in Abbildung 2 gesehen, und auch in der nächsten Abbildung ist dieser Versuch noch einmal zu sehen:

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Ergebnis der Dichtegradientenzentrifugation bei konservativer Replikation

Nun geht der Versuch aber weiter. Nachdem die Bakterien auf dem Nährboden mit den 15N-Atomen wuchsen, hat man sie auf einen normalen Nährboden mit 14N-Atomen verfrachtet. Jetzt konnten die Bakterien keine 15N-Atome mehr in ihre DNA einbauen. Durch Zugabe bestimmter Chemikalien konnte man die Bakterien dazu bringen, dass sich alle gleichzeitig teilten. Man spricht hier von einer synchronen Zellteilung. Vor dieser Zellteilung wird auch die DNA der Bakterien verdoppelt, es findet also eine DNA-Replikation statt.

Nach der ersten synchronen Zellteilung wurde die DNA dieser Bakterien isoliert und wieder einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen.

Wenn sich die DNA nach dem konservativen Mechanismus verdoppelt, dann müsste man jetzt zwei verschiedene DNA-Banden in dem Reagenzglas erwarten. Nämlich eine Bande für die ursprüngliche 15N-DNA, und eine Bande für die neugebildete 14N-DNA:

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Erklärung der Versuchsergebnisse

In den Reagenzgläsern fand man aber nur eine DNA-Bande. Diese Bande befand sich genau zwischen dem 14N-Bereich und dem 15N-Bereich, wie der Vergleich mit der Zentrifugation von 14N-DNA zeigt.

Es gibt genau zwei Erklärungen für dieses Ergebnis: Die DNA wird entweder semikonservativ oder dispers repliziert. Den konservativen Mechanismus konnte man nach diesen Versuch ausschließen, er hätte definitiv zwei Banden lieferen müssen, eine bei 14N und eine bei 15N.

Meselson und Stahl waren sicherlich sehr zufrieden mit diesen Ergebnissen, aber ganz zufrieden waren sie sicherlich nicht. Es gab ja immer noch zwei verschiedene Replikationsmechanismen, die in Frage kamen, der semikonservative und der disperse.

Was machten die beiden Forscher? Sie ließen die Bakterien nach der ersten Replikationsrunde noch weiter auf dem 14N-Nährboden wachsen. Nach einer zweiten Replikationsrunde isolierten sie wieder die DNA und unterwarfen sie einer Dichtegradientenzentrifugation.

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Ergebnis der Dichtegradientenzentrifugation nach zwei synchronen Teilung der Zellen

Jetzt fanden sie Forscher zwei Banden im Reagenzglas, eine zwischen 14 und 15, und eine eindeutig im Bereich 14. Dieses Ergebnis konnte nicht mehr mit dem dispersen Mechanismus erklärt werden, wohl aber mit dem semikonservativen.

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Die Erklärung der Versuchsergebnisse

Die letzte Abbildung zeigt noch einmal eine Erklärung dieses Versuchsergebnisses. Nach der ersten Replikationsrunde besteht die Bakterien-DNA zur Hälfte aus 14N-DNA und 15N-DNA. Nach der zweiten Replikationsrunde wurde der 14N-DNA-Strang mit 14N-Nucleotiden ergänzt, so dass der gesamte Doppelstrang nur noch 14N-Atome enthält. Aber auch der 15N-DNA-Strang wurde mit 14N-Nucleotiden ergänzt. Der so entstandene Doppelstrang besteht zur Hälfte aus 14N-DNA und zur Hälfte aus 15N-DNA.

Nach dem dispersen Mechanismus würden alle Tochterstränge grundsätzlich sowohl14N-DNA wie auch 15N-DNA enthalten, es dürfte also nur eine DNA-Bande im Reagenzglas zu sehen sein. Mit jeder neuen Zellteilung in 14N-Nährmedium würde die DNA allerdings immer mehr 14N-Atome enthalten und damit immer leichter werden.

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