Helmichs Biologie-Lexikon

Lichtmikroskopie, Verfahren

Hellfeld-Mikroskopie

Dieses Verfahren kennt jeder aus dem Biologie-Unterricht, es ist die ganz "normale" Methode, mit der man tote und lebende Objekte mikroskopieren kann. Mit diesem Verfahren arbeiteten schon die Pioniere der Mikroskopie, Robert Hooke und Antoni van Leeuwenhoek.

Geschichte der Lichtmikroskopie

Auf dieser Seite in dem Biologie-Lexikon dieser Homepage wird auf die Anfänge der Lichtmikroskopie im 16. und 17. Jahrhundert eingegangen.

Eine Lichtquelle bestrahlt das Objekt von unten. Der Lichtstrahl kann durch einen Kondensor modifiziert werden. Das Licht fällt durch das transparente Objekt in das Objektiv. Das vom Objektiv erzeugte Bild wird dann vom Okular noch einmal 5x, 10x, 12x oder 15x vergrößert, bevor es ins Auge der Betrachterin fällt.

Ist das Objekt sehr kontrastarm, so gibt es einige Färbemethoden, mit denen man bestimmte Teile des Objektes selektiv anfärben kann, beispielsweise die Zellwände oder den Zellkern.

Hellfeld

Auf dieser Seite der Universität Wien finden Sie alles Wissenswerte über die Hellfeld-Mikroskopie mit Beispiel-Bildern und genauen Anleitungen. Auch auf weiterführende Themen wie Köhlersche Beleuchtung, Kontrasterzeugung und schiefe Beleuchtung wird hier eingegangen.

Dunkelfeld-Mikroskopie

Mit einem einfachen Lichtmikroskop kann man dieses Verfahren ein bisschen simulieren, wenn man den Filterhalter unter dem Kondensor ein wenig in den Lichtstrahl schwenkt. Bei einer bestimmten Position des Filterhalters erscheint der Hintergrund plötzlich schwarz, und die Objekte auf dem Objektträger leuchten hell vor dem schwarzen Hintegrund auf.

Es gibt natürlich richtige Dunkelfeld-Mikroskope, bei denen dieses Verfahren perfektioniert ist. Hier wird das Objekt nicht mit normalem Licht bestrahlt, sondern mit einem Licht-Hohlkegel. Auf das Objekt selbst fällt so kein Licht mehr, aber die Umgebung des Objektes wird beleuchtet.

Dunkelfeld

Auf dieser Seite der Universität Wien finden Sie alles Wissenswerte über die Dunkelfeld-Mikroskopie mit Beispiel-Bildern und genauen Anleitungen. Auch auf weiterführende Themen wie technische Voraussetzungen, Einstellen des Dunkelfeldes oder die Rheinberg-Beleuchtung wird hier eingegangen.

Phasenkonstrast-Mikroskopie

Auch dieses Verfahren ist schon recht alt, es wurde von Frits Zernike in den 30er Jahren des letzten Jahrhunderts entwickelt. 1953 erhielt er dafür den Physik-Nobelpreis.

Phasenkonstrast kann nicht mehr mit einem normalen Lichtmikroskop simuliert werden. Spezielle Ringblenden werden in den Strahlengang eingebracht, die den Konstrast in dem Präparat erheblich steigern. Im Prinzip kann man Phasenkonstrast-Mikroskopie mit einem gängigen Lichtmikroskop betreiben, man muss nur in einen speziellen Phasenkonstrast-Kondensor und spezielle Phasenkonstrast-Objekte investieren.

Phasenkontrast

Auf dieser Seite der Universität Wien finden Sie alles Wissenswerte über die Phasenkonstrast-Mikroskopie mit Beispiel-Bildern und genauen Anleitungen. Auch auf weiterführende Themen wie technische Voraussetzungen, Einstellen des Phasenkontrastes oder das Phasenkontrastbild wird hier eingegangen.

Polarisations-Mikroskopie

Wie auch die vorherigen Verfahren beruht die Polarisations-Mikroskopie auf einer Modifizierung des einfallenden Lichtes. Und zwar wird hier, wie der Name schon andeutet, mit polarisiertem Licht gearbeitet. Bestimmte Strukturen des Objektes werden daduch besonders hervorgehoben.

Polarisation

Auf dieser Seite der Universität Wien finden Sie alles Wissenswerte über die Polarisations-Mikroskopie mit Beispiel-Bildern und genauen Anleitungen. Auch auf weiterführende Themen wie Grundprinzip, technische Voraussetzungen oder Einstellen des Polarisations-Mikroskops wird eingegangen.

Differential-Interferenz-Mikroskopie

Dieses Verfahren ähnelt der Polarisations-Mikroskopie, allerdings wird das polarisierte Licht durch ein Prisma in zwei Strahlen zerlegt, die dann zwei gleiche Bilder erzeugen. Wenn die beiden Bilder dann wieder - leicht verschoben - zusammengesetzt werden, entsteht ein Bild, das irgendwie dreidimensional aussieht. Natürlich ist es nicht wirklich dreidimensional, dazu bräuchte man zwei Objektive und zwei Okulare, so wie bei einem Stereomikroskop, sondern pseudo-dreidimensional.

Interferenzkontrast

Auf dieser Seite der Universität Wien finden Sie alles Wissenswerte über die Interferenzkonstrast-Mikroskopie mit Beispiel-Bildern und genauen Anleitungen. Auch auf weiterführende Themen wie technische Voraussetzungen, Bautypen, Einstellen des Interferenzkontrastes und das Gangunterschieds oder das erzeugte Bild wird hier eingegangen.

Fluoreszenz-Mikroskopie

Dieses Verfahren funktioniert mit Hilfe von Antikörpern, die sich an bestimmte Zellstrukturen setzen, zum Beispiel an die Ribosomen oder Mikrotubuli. Die Antikörper selbst kann man zwar nicht sehen, aber man verbindet sie vorher mit Farbstoffen, die im UV-Licht fluoreszieren. Bestrahlt man das Objekt nun mit normalem Licht und gleichzeitig aus einer zweiten Lichtquelle mit UV-Licht oder kurzwelligem Licht, dann strahlen diese Farbstoffe auf und heben die Organelle, an denen sie gebunden sind, deutlich hervor - und nur diese Organelle. Man sieht also nur die Ribosomen oder nur die Mikrotubuli vor einem normalen Hintergrund hell und farbig strahlend, allerdings viel größer, als sie in Wirklichkeit sind, weil die Fluoreszenzfarbstoffe ziemlich intensiv alles überstrahlen.

Aber die meisten modernen Erkenntnisse über den Aufbau von Zellen verdanken wir der Fluoreszenz-Mikroskopie (und natürlich der Elektronenmikroskopie, von der hier ja aber nicht die Rede ist).

Konfokale Laser-Raster-Lichtmikroskopie (CLSM)

Hier tastet ein sehr enger Laserstrahl das Objekt Punkt für Punkt, Zeile für Zeile und Ebene für Ebene ab. Am Computer kann man so ein dreidimensionales und extrem hochauflösendes Bild des Objektes erhalten. Dieses Verfahren gibt es erst seit 1969, beruht allerdings auf Erfindungen, die schon lange vorher gemacht wurden, zum Beispiel der Nipkow-Scheibe von 1883 und dem Punkt-Scanner von 1955.

Fluoreszenz

Auf dieser Seite der Universität Wien finden Sie alles Wissenswerte über die Fluoreszenz-Mikroskopie mit Beispiel-Bildern und genauen Anleitungen. Auch auf weiterführende Themen wie Grundlagen, Fluorochrome oder CLSM wird hier eingegangen.

Stimulated Emission Depletion (STED)

Ein punktförmiger Beleuchtungsstrahl regt die mit Fluoreszenzfarbstoffen markierten Bereiche der Zelle zum Leuchten an. Ein zweiter Strahl mit einer bestimmten Wellenlänge erfasst nun die Randbereiche des ersten Strahls und versetzt die Fluoreszenzfarbstoffe wieder in ihren Grundzustand, so dass sie nicht mehr strahlen. Auf diese Weise wird der fluoreszierende Bereich stark eingeengt, und das Auflösungsvermögen des Mikroskops steigt enorm an, nämlich auf das Zehnfache des bisher erreichten. Erfunden wurde diese Art der Lichtmikroskopie von Prof. Stefan Hell, der dafür 2014 den Chemie-Nobelpreis bekam.

STED

In diesem Film der Max-Planck-Gesellschaft finden Sie alles Wissenswerte über die verschiedenen Verfahren der Fluoreszenz-Mikroskopie. Am Ende wird kurz auf das STED-Verfahren eingegangen.

Lichtblicke in die Nanowelt

Ein weiteres Video der Max-Planck-Gesellschaft. Hier erläutert der Erfinder der STED-Mikroskopie, Stefan Hell (Chemie-Nobelpreis 2014), das Verfahren ausführlich und sehr anschaulich.

Quellen:

  1. Plattner, Hentschel. Zellbiologie, 5. Auflage. Stuttgart 2017.
  2. "Lichtmikroskopie online - Theorie und Anwendung" auf www.univie.ac.at.
  3. Videos der Max-Planck-Gesellschaft: STED und Lichtblicke in die Nanowelt.