Home > Biologie > Genetik > Gentechnik > Ein gentechnisches Verfahren

Nachweis klonierter Zellen

Voraussetzungen

Damit eine Bakterienzelle Insulin produzieren kann, müssen zwei wichtige Bedingungen erfüllt sein:

  1. Die Bakterienzelle muss ein Plasmid aufnehmen.
  2. Das aufgenommene Plasmid muss ein Insulingen enthalten.

Nur ein Bruchteil der Wirtszellen nimmt ein Plasmid auf. Und nur ein Bruchteil aller aufgenommenen Plasmide enthält die Passagier-DNA an der richtigen Stelle. Wie kann man die wenigen erfolgreich transformierten Bakterienzellen, die beide Bedingungen erfüllen, überhaupt wiederfinden?

Zunächst einmal muss ein Test auf erfolgreiche Transformation durchgeführt werden: Bedingung 1 - Wurde ein Plasmid aufgenommen?

Dann erfolgt ein Test auf erfolgreiche Rekombination: Bedingung 2 - Wurde ein Vektor mit der Passagier-DNA aufgenommen?.

Dann muss schließlich getestet werden, ob die Bedingung 3 erfüllt ist - Wurde das Insulingen so eingebaut, dass Insulin-mRNA transkribiert und Insulin produziert werden kann?

Transformationsnachweis

Man nimmt nicht irgendwelche Plasmide als Vektoren, sondern solche, die ein Gen für die Resistenz gegen das Antibiotika Tetracyclin besitzen (und zusätzlich ein Gen für Ampicillin-Resistenz).

Bakterienkolonien

Welche Bakterien haben Bedingung 1 erfüllt?

Züchtet man die Bakterien auf einem Tetracyclin haltigen Nährboden, überleben nur die transformierten Bakterien. Denn nur die transformierten Bakterien sind wegen ihres Plasmids resistent gegen Tetracyclin. Alle Bakterien, die kein Plasmid aufgenommen haben, sterben ab.

Rekombinationsnachweis

Die überlebenden Bakterien werden weitergezüchtet. Jetzt kommt das Gen für die Ampicillin-Resistenz ins Spiel. Dieses Gen enthält nämlich die Schnittstelle für die Restriktionsendonuclease, was natürlich kein Zufall ist, sondern man hat die Restriktionsendonuclease entsprechend ausgewählt, dass sie mitten im Ampicillin-Resistenz-Gen schneidet.

Auf diese Weise wird die Passagier-DNA mitten in das Gen eingebaut. Die erfolgreich transformierten Bakterien erfüllen jetzt zwei Kriterien:

  1. Sie sind resistent gegen Tetracyclin, weil sie das Plasmid enthalten.
  2. Sie sind nicht resistent gegen Ampicillin, weil das Insulingen mitten in das Gen für Ampicillin-Resistenz eingebaut wurde.

Wie kann man jetzt die Bakterien isolieren, die die beiden Kriterien erfüllen? Wenn man die Bakterien auf einem Ampicillin haltigen Nährboden züchtet, sterben alle Bakterien ab, die beide Kriterien erfüllen. Das sind leider genau die Bakterien, die man für die Insulinproduktion gebrauchen könnte.

Stempeldtechnik

Anwendung der Stempeltechnik zum Rekombinationsnachweis

Nun kommt eine neue Technik ins Spiel, die Stempeltechnik. Mit Hilfe dieser Stempeltechnik kann man eine Kopie der Bakterienkolonien anfertigen, bevor man das Ampicillin einsetzt. Man drückt dazu einen mit Samt überzogenen Stempel auf die Petrischale mit den Bakterien, so dass von jeder Kolonie einige Individuen im Samt hängen bleiben. Dann drückt man den Stempel in eine neue Petrischale mit Ampicillin und bebrütet diese einige Stunden bis Tage. In der so angefertigten Kopie entstehen dann neue Kolonien an genau der gleichen Stelle wie im Original. Anschließend entnimmt man im Original die Bakterien, die in der Kopie abgestorben sind.