Home > Biologie > Genetik > Gentechnik > Ein gentechnisches Verfahren

Nachweis klonierter Zellen

Voraussetzungen

Damit eine Bakterienzelle Insulin produzieren kann, müssen zwei wichtige Bedingungen erfüllt sein:

  1. Die Bakterienzelle muss ein Plasmid aufnehmen.
  2. Das aufgenommene Plasmid muss die Passagier-DNA mit dem Insulingen enthalten.
  3. Das Insulingen muss an der richtigen Stelle im Plasmid sitzen.

Nur ein Bruchteil der Wirtszellen nimmt überhaupt ein Plasmid auf. Und nur ein Bruchteil dieser aufgenommenen Plasmide enthält die Passagier-DNA an der richtigen Stelle. Wie kann man die wenigen erfolgreich transformierten Bakterienzellen, die diese drei Bedingungen erfüllen, überhaupt wiederfinden?

Zunächst einmal muss ein Test auf erfolgreiche Transformation durchgeführt werden: Bedingung 1 - Wurde ein Plasmid aufgenommen?

Dann erfolgt ein Test auf erfolgreiche Rekombination: Bedingung 2 - Wurde ein Vektor mit der Passagier-DNA aufgenommen?.

Dann muss schließlich getestet werden, ob die Bedingung 3 erfüllt ist - Wurde das Insulingen so eingebaut, dass Insulin-mRNA transkribiert und Insulin produziert werden kann?

1. Transformationsnachweis

Der Transformationsnachweis, also der Nachweis, dass Bakterien ein Plasmid aufgenommen haben, ist recht simpel. Man nimmt nicht irgendwelche Plasmide als Vektoren, sondern solche, die ein Gen für die Resistenz gegen das Antibiotika Tetracyclin besitzen. Für den Transformationsnachweis wäre das schon ausreichend. Für weitere Untersuchungen hat man aber auch noch ein Gen für Ampicillin-Resistenz in das Plasmid eingebaut.

Bakterienkolonien

Das präparierte Plasmid
Autor: Ulrich Helmich 2006, Lizenz: siehe Seitenende.

Hier sehen wir ein solches Plasmid, in das die Passagier-DNA schon erfolgreich eingebaut wurde. Das Gen für die Tetracyclin-Resistenz ist intakt geblieben.

Bakterienkolonien

Der erste Selektionsvorgang
Autor: Ulrich Helmich 2006, Lizenz: siehe Seitenende.

Für den Transformationsnachweis legt man nun Kulturen der manipulierten Bakterien auf einen Nährboden an, der das Antibiotikum Tetracyclin enthält. Alle Bakterien, die kein Plasmid aufgenommen haben, sterben hier ab. Nur die Bakterien mit einem aufgenommenen Plasmid überleben, weil sie ja ein Tetracyclinresistenz-Gen auf dem Plasmid besitzen.

Man lässt sich diese Bakterien nun vermehren, und in kurzer Zeit hat man gut sichtbare Kolonien auf dem Nährboden. Von diesen Kolonien entnimmt man nun einige Bakterien und führt mit ihnen den Rekombinationsnachweis durch.

2. Rekombinationsnachweis

Die entnommenen Bakterien werden jetzt weitergezüchtet. Nun kommt das zweite Gen für Antibiotika-Resistenz in Spiel, das Gen für die Ampicillin-Resistenz, das wir oben bereits kurz erwähnt hatten.

Dieses Gen enthält nämlich die Schnittstelle für die Restriktionsendonuclease, was natürlich kein Zufall ist, sondern man hat die Restriktionsendonuclease entsprechend ausgewählt, dass sie mitten im Ampicillin-Resistenz-Gen schneidet.

Auf diese Weise wird die Passagier-DNA mitten in das Gen eingebaut, wie man auf Abbildung 1 gut sehen kann. Die Bakterien, die den Prozess bis jetzt "überlebt" haben, erfüllen zwei Kriterien:

  1. Sie sind resistent gegen Tetracyclin, weil sie das Plasmid enthalten.
  2. Sie sind nicht resistent gegen Ampicillin, weil das Insulingen mitten in das Gen für Ampicillin-Resistenz eingebaut wurde.

Wie kann man jetzt die Bakterien isolieren, die diese beiden Kriterien erfüllen? Wenn man die Bakterien auf einem Ampicillin haltigen Nährboden züchtet, sterben alle Bakterien ab. Das ist nicht gerade hilfreich.

Weitsichtige Computer-User führen regelmäßig Backups ihrer wichtigsten Daten durch. Dazu kopiert man alle in Frage kommenden Daten von Festplatte A auf Festplatte B. Löscht man dann aus Versehen einige Dateien von Festplatte A, kann man diese von Festplatte B zurück kopieren und umgekehrt.

Ähnlich verfährt man nun mit den Nährboden für die Bakterien.

Der zweite Selektionsschritt
Autor: Ulrich Helmich 2006, Lizenz: siehe Seitenende.

Links sehen wir einen Tetracyclin haltigen Nährboden mit Kolonien von Bakterien, die den ersten Selektionsschritt überlebt haben. Mit Hilfe eines Samtstempels überträgt man Bakterien von diesem Nährboden auf einen Ampicillinhaltigen Nährboden (Stempeltechnik).

Samt ist ein sehr feinfaseriges Material, und wenn man den Samtstempel auf den Nährboden mit den Kolonien drückt, bleiben viele Bakterien an den feinen Härchen hängen. Drückt man diesen Stempel mit den Bakterien nun auf einen neuen Nährboden, werden einige dieser Bakterien auf den neuen Nährboden übertragen. Wenn man den Stempel dabei nicht dreht, befinden sich die Bakterien auf dem neuen Nährboden an genau der gleichen Stelle wie auf dem alten Nährboden. Man kann so eine perfekte Kopie der Kolonien anfertigen.

Nach der Übertragung der Kolonien auf den Nährboden mit dem Antibiotikum Ampicillin lässt man die Kolonien einige Zeit wachsen. Nicht alle Bakterien überleben diese Prozedur. Diejenigen Bakterien, die kein Insulingen mitten im Ampicillingen besitzen, haben ein intaktes Ampicillingen und sind folglich resistent gegen Ampicillin. Mit diesen überlebenden Bakterien kann man jetzt nichts weiter anfangen.

Interessant sind die Bakterien, die nicht überlebt haben. Aber man hat ja zum Glück nur mit einer Kopie gearbeitet, das Original ist noch unangetastet. Die Kolonien mit den Nummern 3 und 6 können jetzt von dem Original entnommen und weitergezüchtet werden. Diese Bakterien erfüllen alle drei Bedingungen, die wir oben im Text genannt hatten:

  1. Die Bakterienzelle muss ein Plasmid aufnehmen.
  2. Das aufgenommene Plasmid muss die Passagier-DNA mit dem Insulingen enthalten.
  3. Das Insulingen muss an der richtigen Stelle im Plasmid sitzen.
Bedingung 1 wurde durch den Transformationsnachweis überprüft (Selektionsschritt 1), und die beiden anderen Bedingungen wurden durch den Rekombinationsnachweis überprüft (Selektionsschritt 2).