Denaturierung von Proteinen

Versuch zur Denaturierung von Proteinen

Denaturierung

Bei der Denaturierung eines Proteins verändert sich dessen Tertiärstruktur, teilweise sind auch die Sekundärstrukturen davon betroffen. Die Primärstruktur bleibt aber meistens erhalten, die Reihenfolge der Aminosäuren wird durch eine Denaturierung in der Regel also nicht verändert.

Wenn sich die Tertiärstruktur des Proteins verändert, geht automatisch auch seine Funktion verloren. Ein Enzym beispielsweise verliert seine enzymatische Aktivität.

Denaturierung durch Hitze

Bei der Hitzedenaturierung werden zunächst schwache chemische Bindungen (zum Beispiel van-der-Waals-Kräfte) aufgebrochen. Das liegt daran, dass durch die Zufuhr thermischer Energie die Protein-Moleküle in Schwingungen geraten. Je höher die Temperatur, desto stärker die Schwingungen, bis schließlich sogar starke kovalente Bindungen aufgebrochen werden. Solche Hitzedenaturierungen können unter Umständen reversibel sein.

Fieber

Lebewesen werden durch Hitze geschädigt. Bei Temperaturen über 40 ºC beginnen auch die Proteine des menschlichen Körpers zu denaturieren, manche Proteine etwas eher, manche etwas später. Das gilt auch für die Proteine von eingedrungenen Krankheitserregern (Viren, Bakterien etc.). Darum erhöht der Körper seine Temperatur, wenn man sich infiziert hat. Ziel des Fiebers ist es, die Krankheitserreger durch Denaturierung ihrer Proteine abzutöten. Zu hohes Fieber ist allerdings gefährlich, weil dann ja auch die körpereigenen Proteine gefährdet sind. Darum sollte man bei hohem Fieber Gegenmaßnahmen ergreifen (Medikamente, Wadenwickel etc.).

Disulfid-Brücken

Auch Disulfid-Brücken können durch Hitzedenaturierung aufgebrochen werden. Meistens ist diese Art der Denaturierung irreversibel. Ein einmal gekochtes Hühnerei kann nicht mehr in den ursprünglichen flüssigen Zustand zurückversetzt werden.

Sterilisieren

Anwendungen findet die Hitzedenaturierung zum Beispiel beim Autoklavieren, also beim Sterilmachen medizinischer Geräte durch Hitze (> 100 ºC) und erhöhtem Druck.

Enzyme haben ein Temperaturoptimum

Temperaturabhängigkeit der Aktivität eines Enzyms
Autor: Ulrich Helmich 2021, Lizenz: Lizenz: CC BY-NC-SA 4.0

In der Abbildung sehen wir, wie die Aktivität eines Enzyms von der Temperatur abhängt. Es handelt sich hier um eine typische Optimumskurve, bei einer Temperatur von 30 Grad Celsius arbeitet unser Beispielenzym am besten. Bei kälteren Temperaturen setzt das Enzym seine Substrate nicht mehr so schnell um. Das liegt eindeutig an der RGT-Regel (Reaktionsgeschwindigkeits-Temperatur-Regel): Eine Erhöhung der Temperatur um 10 ºC verdoppelt die Geschwindigkeit biochemischer Reaktionen.

Eigentlich müsste das Enzym bei 40 ºC doppelt so schnell arbeiten wie bei 30 ºC. Das ist aber nicht der Fall, im Gegenteil, die Enzymaktivität sinkt rapide. Das liegt an der zunehmenden Denaturierung des Enzyms. Die Tertiärstruktur verändert sich, und das wirkt sich auch auf das aktive Zentrum des Enzyms aus, das ja für die Verarbeitung des Substrats verantwortlich ist. Das Schlüssel-Schloss-Prinzip funktioniert nicht mehr. Wenn das Schloss verformt ist, passt der Schlüssel nicht mehr hinein.

Entfaltung eines Proteins durch Hitze
Scurran15, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons

Auf diesem Bild ist sehr schön dargestellt, wie sich ein globuläres Protein unter Hitzeeinwirkung entfaltet.

Denaturierung durch Säuren und Laugen

Säuren

Veränderung der Tertiärstruktur durch Zugabe einer Säure
Autor: Ulrich Helmich, Lizenz: siehe Seitenende

Säuren wie beispielsweise HCl (Salzsäure) geben Protonen H⁺ ab, die sich dann an negativ geladene Carboxy-Gruppen in den Seitenketten der sauren Aminosäuren setzen können:

$R-COO^{-} + H^{+} \to R-COOH$

Diese Seitenketten verlieren dann ihre negativen Ladungen, und der Zusammenhalt der Tertiärstruktur an diesen Stellen geht dann verloren, weil die positiv geladenen "gegenüberliegenden" Aminosäuren keinen Bindungspartner mehr haben.

Laugen

Veränderung der Tertiärstruktur durch Zugabe einer Säure
Autor: Ulrich Helmich, Lizenz: siehe Seitenende

Laugen enthalten Hydroxid-Ionen OH^-, die Protonen aus dem Protein aufnehmen können, vor allem aus den positiven NH₃⁺-Gruppen in den Seitenketten der basischen Aminosäuren.

$R-NH_3^{+} + OH^{-} \to R-NH_2 + HOH$

Dadurch verlieren die positiv geladenen Seitenketten basischer Aminosäuren wie Lysin oder Arginin ihre positive Ladung, mit dem gleichen Effekt wie bereits eben beschrieben.

Der durch die Lauge verursachte Mangel an Protonen im Lösemittel kann sich auch die die Wasserstoffbrücken-Bindungen auswirken, die die Sekundärstrukturen (alpha-Helix, beta-Faltblatt) der Proteine zusammenhalten.

Hydrolyse schädigt die Primärstruktur

Schließlich kann durch einen starken Überschuss an Säure oder Lauge sogar eine Hydrolyse des Proteins stattfinden, dass heißt, eine Spaltung von Peptidbindungen. Diese Art der Denaturierung wirkt sich dann sogar auf die Primärstruktur aus.

Enzyme haben ein pH-Optimum

pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität von drei unterschiedlichen Enzymen.
Gal m, CC BY 3.0, via Wikimedia Commons.

Auf diesem Bild sieht man drei verschiedene Enzyme und wie ihre Aktivität vom pH-Wert abhängig ist. Das blau gezeichnet Enzym hat beispielsweise eine optimale Aktivität bei einem pH-Wert von 2 - 3, das orange gezeichnet Enzym hat sein pH-Optimum bei pH 6 - 8, und das grün gezeichnet Enzym hat sein pH-Optimum im stark alkalischen Bereich, schätzungsweise pH 10 - 11.

Die Enzyme unseres Verdauungssystems unterscheiden sich ebenfalls in ihrer pH-Abhängigkeit. Das Pepsin des Magens muss zum Beispiel bei stark sauren pH-Werten (teils < 2) optimal arbeiten. Im Dünndarm dagegen herrscht ein leicht alkalisches Milieu. Das Trypsin, das Chymotrypsin etc. muss also bei pH-Werten um 8 gut arbeiten. Pepsin, das mit dem Nahrungsbrei in den Dünndarm gelangt, wird dort sofort inaktiv.

Denaturierung durch Salze

Salze bestehen aus positiv und negativ geladenen Ionen. Diese können mit den negativ bzw. positiv geladenen Seitenketten des Proteins wechselwirken, so dass die Ionenbindungen zerstört werden, welche die Tertiärstruktur zusammenhalten.

Denaturierung durch Schwermetalle

Schwermetalle wie Kupfer (Blei, Cadmium etc.) reagieren mit den Schwefelresten in den Seitenketten von Cystein zu schwerlöslichen Cu-S-Verbindungen. Außerdem können die positiv geladenen Metall-Ionen ebenfalls mit den negativ geladenen Carboxylgruppen in den Seitenketten der sauren Aminosäuren Komplexe bilden. Gerade Kupfer-Ionen bilden sehr feste Bindungen zum Protein aus, so dass diese Art der Denaturierung irreversibel ist.

Denaturierung durch Tenside

Auch Tenside aus Waschmitteln oder Spülmitteln können Proteine denaturieren, wie das folgende Bild schön zeigt:

Denaturierung durch Ethanol und andere organische Lösemittel

Ethanol und andere Alkohole wirken sich vor allem auf H-Brücken und hydrophobe Wechselwirkungen aus, welche die Sekundär- und Tertiärstruktur stabilisieren. Diese Art der Denaturierung wird beim Desinfizieren angewandt.

Denaturierung durch destilliertes Wasser

Natürlich vorkommende Proteine liegen nie isoliert vor, sondern sind mit Salzen und organischen Molekülen assoziiert, die teilweise auch für den Erhalt der Tertiärstruktur verantwortlich sind. Entfernt man diese Komponenten durch Dialyse, kann die Raumstruktur oft nicht mehr aufrecht erhalten werden, es kommt ebenfalls zu einer Denaturierung.

Denaturierung durch Luftsauerstoff

Sauerstoff kann auf Cystein-Reste einwirken und aus den SH-Gruppen Sulfongruppen machen -SO₃H.

Erklärung des Ausflockens

Gibt man genug Essig in einen Topf mit Milch, so flockt diese aus. Offensichtlich führt die Zugabe der Säure zu einer Erniedrigung der Wasserlöslichkeit des Milchproteins. Das kann man folgendermaßen erklären:

Im Innern des gefalteten Proteins befinden sich viele hydrophobe Aminosäuren. Das hat energetische Gründe, in einem polaren Lösemittel wie Wasser ist es energetisch ungünstig, wenn sich die hydrophoben Aminosäuren im Außenbereich befinden.

Durch das Entfalten des Proteins gelangen diese hydrophoben Seitenketten nun in Kontakt mit Wasser und erniedrigen so die Wasserlöslichkeit des Proteins.

Aber das ist nicht der einzige und wichtigste Effekt. Der Kontakt von hydrophoben Seitenketten mit dem Wasser ist energetisch ungünstig. Die einzelnen entfalteten Proteinketten lagern sich jetzt neu zusammen, und zwar so, dass die hydrophoben Seitenketten miteinander in Kontakt kommen. So bilden sich immer größere "Klumpen" aus Proteinketten, die man dann mit bloßem Auge als "Flocken" beobachten kann.

Solche Prozesse spielen auch eine wichtige Rolle, wenn man ein Ei kocht, ein Spiegelei zubereitet oder Brot oder Kuchen backt.